蛋白質(zhì)技術(shù)專題：聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度

（一）原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng)?！安贿B續(xù)系統(tǒng)”大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng)；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實(shí)驗(yàn)中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，pH8.3?？梢姡z濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同，形成了一個不連續(xù)系統(tǒng)。
電泳時，蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上，為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴(kuò)散，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合，以提高密度；為觀察蛋白質(zhì)樣品泳動的情況，樣品中還加入溴酚藍(lán)等示蹤染料，這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動的速度都快，只要染料未泳動出凝膠管，樣品就沒有走出膠管的危險。
在不連續(xù)系統(tǒng)中，當(dāng)接通電源開始電泳時，系統(tǒng)中的甘氨酸、蛋白質(zhì)、HCl中的氯離子和溴酚藍(lán)等均解離為陰離子，形成離子流向陽極泳動。其遷移率取決于離子的電荷數(shù)、分子量大小及形狀。然而，當(dāng)電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進(jìn)入濃縮膠時，它們遇到了比pH8.3低的pH（6.7），pH下降了近兩個單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點(diǎn)（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢。血清樣品中個蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠，pH的改變雖對其解離度有影響，但比對甘氨酸要小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質(zhì)分子不會造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離，分子量很小，摩擦力不大，其遷移率比蛋白質(zhì)、溴酚藍(lán)都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍(lán)
甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降，造成移動離子流的突然缺失，出現(xiàn)電流減小電導(dǎo)率下降。然而，整個電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變，根據(jù)電導(dǎo)及電位梯度成反比（E=I/n，E為電位梯度，I為電流強(qiáng)度，n為電導(dǎo)率）的關(guān)系，于是在前導(dǎo)離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質(zhì)各成分，在高電場作用下迅速以不同的速度（分子量不同、帶電量不同）泳向前導(dǎo)Cl-離子區(qū)域。當(dāng)?shù)竭_(dá)前導(dǎo)Cl-區(qū)域時因不缺少離子，大的電場強(qiáng)度減弱，離子移動速度急速減慢下來，其結(jié)果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過這個過程，是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。
當(dāng)離子流繼續(xù)向前，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現(xiàn)象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復(fù)具有恒定的電場強(qiáng)度，蛋白質(zhì)的分離完全按一般區(qū)帶點(diǎn)用方式進(jìn)行。
由以上的原理可見，聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠。蛋白質(zhì)各成分預(yù)先分開且壓縮成層，可以減少在電泳時，成分間由于自由擴(kuò)散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來的干擾，這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個優(yōu)點(diǎn)，少量的蛋白質(zhì)樣品（1-100??g）也能分離得很好，分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個區(qū)帶。

（二）試劑和器材
1．測試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。
2．試劑

（1）制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑
① 凝膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，調(diào)pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶，4℃貯存。
② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存，一般可放置1個月左右。
③ 分析純過硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶，4℃儲存僅能用一周，好當(dāng)天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。
④ 濃縮膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml，Tris5.98g，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,調(diào)pH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存。
⑤ 濃縮膠貯液：稱Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，過濾后置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg，加重蒸餾水溶解，定容至100ml，置棕色試劑瓶內(nèi)，4℃貯存。

（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml，調(diào)pH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中，4℃貯存，臨用前稀釋10倍。
（3）0．1%溴酚藍(lán)指示劑
（4）染色液 染色液種類較多，染色方法也不完全相同。本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250染色液中，含20%磺基水楊酸，其優(yōu)點(diǎn)是染色、固定同時進(jìn)行，背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍(lán)R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍(lán)0.05g，磺基水楊酸20g，加蒸餾水至100ml，過濾后置試劑瓶內(nèi)保存。
（5）脫色液 7%乙酸溶液
（6）保存液 甘油10ml，冰乙酸7ml，加蒸餾水至100ml。
（7）1%瓊脂（糖）溶液   瓊脂（糖）1g，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解，4℃貯存，備用。
3．器材   電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。

（三）操作方法

1．安裝夾心式垂直板電泳槽
夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上儲槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下儲槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝：
（1）將上儲槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。
（2）將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上，短玻璃板應(yīng)面對上儲槽。
（4）將下儲槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳蟽Σ?，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。
（5）豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡。

2．配膠
① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，后加AP 10 ml。
② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3．制備凝膠板
不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應(yīng)分2步進(jìn)行。

① 分離膠的制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇終丙烯酰胺的濃度，本實(shí)驗(yàn)需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續(xù)系統(tǒng)?；旌虾蟮哪z溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止?jié)B漏，在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預(yù)電泳，則上、下儲槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數(shù)次，即可制備濃縮膠。

② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細(xì)長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)（即分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽照射，進(jìn)行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開始。繼續(xù)光照30min，使凝膠聚合完全。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm，即可加樣。

4．加樣
作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶。為防止樣品擴(kuò)散，應(yīng)在樣品中加入等體積40%蔗糖（內(nèi)含少許溴酚蘭）。用微量注射器取5ul上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。

5．電泳
將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接（方向切勿接錯）。接通冷卻水，打開電泳儀開關(guān)，開始時將電流調(diào)至10 mA 。待樣品進(jìn)入分離膠時將電流調(diào)至20-30mA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時，將電流調(diào)回到零，關(guān)電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。

6．固定，染色
本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250（內(nèi)含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時進(jìn)行，使染色液沒過膠板，染色30min左右。

7．脫色
用7%乙酸侵泡漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時間。脫色液經(jīng)活性碳脫色后，可反復(fù)使用。