專題蛋白質(zhì)技術(shù)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

[原理]

蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。

聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時(shí)，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移動(dòng)，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。

[試劑]

1、30%凝膠貯備液：稱取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），加蒸餾水至100ml，濾紙過濾貯存。

2、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。

3、10%過硫酸胺（AP）

4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）

5、5×電泳緩沖液：于900ml蒸餾水中分別加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混勻后加蒸餾水至1 000ml。

6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)

7、電泳加樣緩沖液

10mmol/LpH6.8 Tris

200mmol/LDTT

4%SDS

0.2% 溴酚蘭

20% 甘油

8.正丁醇

[器材]

1、移液器

2、移液管

3、燒杯

4、垂直電泳槽

5、電泳儀

[操作步驟]

1.配制分離膠濃度8%、體積15ml

H2O 6.9ml

30%凝膠貯備液 4.0ml

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml

10%SDS 0.15ml

10%過硫酸胺 0.15ml

TEMED 0.01ml

2.一旦加入TEMED，混勻后立即小心地將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，為成層膠留有足夠空間。用毛細(xì)管輕輕在其頂層加入幾毫升正丁醇，以阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。

3.聚合完成之后，倒掉覆蓋液體，用去離子水洗凝膠上部數(shù)次，盡可能用吸水紙吸干頂端的殘存液體。

4.配制5%成層膠5ml，插入梳子，小心避免混入氣泡，垂直放置室溫下。

H2O 3.4ml

30%凝膠貯備液 0.83ml

1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml

10%SDS 0.05ml

10%過硫酸胺 0.05ml

TEMED 0.01ml

5.在成層膠聚合時(shí)，將樣品與加樣緩沖液混勻，100℃加熱3min。

6.成層膠聚合完成后，用去離子水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，將凝膠放入電泳槽上。

7.加樣

8.電泳：開始時(shí)電壓為8V/cm凝膠，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到15V/cm凝膠，繼續(xù)電泳直到染料抵達(dá)分離膠底部，斷開電源。

9.取下凝膠，固定、染色或進(jìn)行Western blot分析。