磷酸化蛋白WB太難了，踩坑無數(shù)后我們總結(jié)了這7條

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蛋白磷酸化，是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸殘基上添加磷酸基團的一種可逆的翻譯后修飾，也是信號轉(zhuǎn)導研究繞不開的話題。

      WB 難，一入 WB 深似海，磷酸化蛋白的 WB 檢測更是難上加難！因為一旦細胞裂解，就會釋放出蛋白酶和磷酸酶，可以降解或修飾蛋白質(zhì)，從而影響檢測結(jié)果。怎么搞定？別急，告訴你 7 個小妙招：

① 將樣品置于冰上，使用預(yù)冷的緩沖液
樣品處理中使用的設(shè)備或緩沖液應(yīng)在冰上（4 ℃）冷藏保存。盡可能使用預(yù)冷的試劑和設(shè)備，可以減緩去磷酸化、蛋白水解和變性。
②  使用磷酸酶抑制劑
在裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑，否則輕者條帶不明顯，重者沒有條帶。*好是添加新鮮配制的蛋白酶-磷酸酶抑制劑混和物。
③ 將樣品儲存在上樣緩沖液（loading buffer）中
蛋白定量后，將樣品與上樣緩沖液混合，遏制磷酸酶活性。隨后可以將樣本等分并儲存在冰箱中或加載到凝膠上。
④  避免使用牛奶作為封閉劑
牛奶中含有大量的一種磷蛋白——酪蛋白，會引起高背景。建議使用牛血清白蛋白BSA或無蛋白的封閉劑。
⑤ 使用無磷酸鹽緩沖液
為盡量減少非特異性信號，用 TBST 代替磷酸鹽緩沖液（PBS）。如果在中間步驟中必須使用 PBS，則應(yīng)在加入蛋白檢測底物前，用大量 TBST 清洗膜，以除去過量的磷酸鈉。
⑥ 使用靈敏的底物進行化學發(fā)光檢測
如需檢測一種弱磷酸化的低豐度蛋白，可使用抗體對蛋白進行免*疫沉淀獲得濃縮的蛋白，并在泳道中上樣更多的蛋白，同時使用高靈敏度的底物進行化學發(fā)光檢測。
⑦ 檢測總蛋白含量
為確定 WB 上信號的缺失是由于磷酸化效率低還是磷酸化蛋白分離不充分，同時需要檢測總蛋白含量。例如，使用配對抗體檢測磷酸化和未修飾的蛋白。

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