PCR實驗如實預(yù)防實驗污染

進行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守些操作規(guī)程，大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜污染的出現(xiàn)。

1.劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：

(1)標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備。

(2)擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴增。

(3)產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

(4)各工作區(qū)要有定的隔離，操作器材專用，要有定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

2.分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

(1) PCR用水應(yīng)為壓的雙蒸水。

(2) 引物和dNTP用壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制。

(3)引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。

3. 實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

(1)戴次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。

(2)使用次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

(3)避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

(4)操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的度。

(5)后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。

(6)操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。

(7)盡可能用可替換或可壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，好使用可替換或壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。

(8)重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。