RNA提取純化的注意事項(xiàng)

由于RNA酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續(xù)工作變得非常困難。

1. RNases 是非常穩(wěn)定和活躍的種酶，般不需要輔助因子的功能，因而在實(shí)驗(yàn)室內(nèi) RNA 很容易被降解
2. 如果不預(yù)先消除可能的 RNase 污染，請(qǐng)不要使用任何塑料制品或玻璃制品
3. 純化的 RNA 溶解在 RNases-free 的水中，在 –20℃或 –70℃進(jìn)行儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)年不會(huì)引起 RNA降解

    對(duì)于使用 RNeasy Kit 進(jìn)行 RNA 純化，般不要求額外的 DNase 消化過(guò)程，這是因?yàn)?QIAGEN的 RNeasy 硅膠膜技術(shù)能夠效去除大部分的 DNA。然而，對(duì)于某些基于 RNA 的敏感應(yīng)用，我們建議同時(shí)使用 RNase-free DNase Set（操作流程可以參見(jiàn) RNeasy 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)）對(duì) DNA 進(jìn)行消化，確保得到的 RNA 無(wú)任何 DNA 的污染。

     RNA工作的主要問(wèn)題是防止RNA酶的污染。除了操作時(shí)需要注意RNA酶，那么針對(duì)不同類(lèi)型的樣本，進(jìn)行RNA純化時(shí)有哪些需要注意的地方呢？

從富含纖維的組織中分離 RNA（如心臟或肌肉組織等）有定難度，這是因?yàn)槔w維組織中的收縮蛋白，結(jié)締組織，膠原等成分都會(huì)干擾 RNA 的純化過(guò)程。所以為了去除這些蛋白的影響，組織樣本需要用含有蛋白酶或含酚的裂解液。同時(shí)上述處理?xiàng)l件不能引起 RNA 降解，QIAGEN 推薦使用 RNase-free proteinase K 進(jìn)行消化。

固定和包埋的過(guò)程能導(dǎo)致核酸的嚴(yán)重降解和化學(xué)修飾，通常我們從 FFPE 樣本中純化得到的核酸的分子量要小于新鮮或冰凍組織。核酸降解/片段化的程度依賴(lài)于樣本類(lèi)型和年齡，另外和固定，包埋和儲(chǔ)存條件也有很大關(guān)系。

請(qǐng)依照以下建議進(jìn)行 FFPE 樣本的處理，以減少對(duì) RNA 的損傷

• 盡快取出組織樣本并進(jìn)行固定
• 組織樣本的厚度不要超過(guò) 5 mm，固定時(shí)間不要超過(guò) 24 小時(shí)
• 使用質(zhì)量試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要使用添加劑
• 如果可能的話，避免對(duì)樣本進(jìn)行染色
• 儲(chǔ)存 FFPE 樣本的條件要合適，如在 4 度進(jìn)行存放長(zhǎng)達(dá) 1 年，仍可純化到品質(zhì) RNA
• 使用合適的脫蠟溶液進(jìn)行脫蠟處理
• 在 RNA 純化過(guò)程要有逆轉(zhuǎn)交聯(lián)的步驟，便于大程度釋放 RNA 分子
• 去除基因組 DNA 的污染

全血中紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，每毫升血液中實(shí)用細(xì)胞數(shù)少，核酸得率比較低，所以從全血中分離的目標(biāo)是白細(xì)胞。此外，還必須除去污染物如抗凝劑肝素和 EDTA 以及天然存在的酶抑制劑，這些物質(zhì)都會(huì)干擾下游的 RNA 分析。QIAamp RNA Blood Kits 度適合從人血液樣本中純化品質(zhì)RNA，能消除 RNases，污染物和酶抑制劑，同時(shí)大程度去除基因組 DNA 的污染。

RNA 尤其是 miRNA 可在血清，血漿，尿液和其他體液中存在，并且也存在于細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中。胞外 RNA 的含量比胞內(nèi) RNA 要低的多，但是它相對(duì)穩(wěn)定，在人全血中的半衰期約為 2天。然而，多次反復(fù)凍融仍然會(huì)導(dǎo)致純化效果變差。推薦純化過(guò)程中使用 carrier RNA 來(lái)提游離 RNA 的回收效率。

些病毒具有單鏈或雙鏈 RNA 基因組。病毒 RNA 通常是分離自無(wú)細(xì)胞體液中，而這些樣本中病毒核酸的含量非常低。 病毒顆?？赡苄枰ㄟ^(guò)超速離心，超濾或沉淀的方式進(jìn)行濃縮。推薦純化過(guò)程中使用 carrier RNA 來(lái)提游病毒 RNA 的回收效率。另外推薦使用合適的逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)某些含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的病毒核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。